Microscopia Eletrônica - LabCEMM/PUCRS

No dia 10/09/2019, nossa turma Biotecnologia II, acompanhados da professora Márcia, visitou o LabCEMM, Laboratório Central de Microscopia e Microanálise, da PUCRS.

O objetivo desta visita foi conhecer e compreender sobre microscopia eletrônica e os  outros tipos de microscopia, com foco no MEV, Microscópio Eletrônico de Varredura.

1. MEV - Microscópio Eletrônico de Varredura

Consiste em utilizar um feixe de elétrons de pequeno diâmetro para explorar a superfície da amostra, ponto a ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma tela catódica cuja varredura está perfeitamente sincronizada com aquela do feixe incidente. Por um sistema de bobinas de deflexão, o feixe pode ser guiado de modo a varrer a superfície da amostra segundo uma malha retangular. O sinal de imagem resulta da interação do feixe incidente com a superfície da amostra. O sinal recolhido pelo detector é utilizado para modular o brilho do monitor, permitindo a observação. A maioria dos instrumentos usa como fonte de elétrons um filamento de tungstênio (W) aquecido, operando numa faixa de tensões de aceleração de 1 a 50 kV. O feixe é acelerado pela alta tensão criada entre o filamento e o ânodo. Ele é, em seguida, focalizado sobre a amostra por uma série de três lentes eletromagnéticas com um spot menor que 4 nm. O feixe interagindo com a amostra produz elétrons e fótons que podem ser coletadas por detectores adequados e convertidas em um sinal de vídeo. Quando o feixe primário incide na amostra, parte dos elétrons difunde-se e constitui um volume de interação cuja forma depende principalmente da tensão de aceleração e do número atômico da amostra. Neste volume, os elétrons e as ondas eletromagnéticos produzidos são utilizados para formar as imagens ou para efetuar análises físico-químicas. Para serem detectados, as partículas e/ou os raios eletromagnéticos resultantes da interação do feixe eletrônico com a amostra devem retornar à superfície da amostra e daí atingirem o detector(1).

Fig.1 - Antena de uma formiga - aumento 1000x.
Fonte: Site "LabCEMM"(2)

2. MEV-FEG - Microscópio Eletrônico de Varredura por Emissão de Campo

O MEV-FEG permite obtenção de imagens detalhadas da morfologia dos materiais com resolução de até 1 nm e determinação do tamanho de partículas de dimensão mínima de 10 nm, ressaltando-se que não é recomendável usar este equipamento para determinar o tamanho de partículas ou de poros com dimensões acima de 100 µm. Com a técnica de MEV-FEG é possível obter imagens de topografia utilizando elétrons secundários (SE), estudar a porosidade, defeitos, contaminações, granulometria e morfologia dos materiais. Esta técnica também permite, com o uso de elétrons retroespalhados (BSE), a obtenção de imagens de compostos distintos em uma mesma amostra e, com o uso da espectroscopia por dispersão em energia de raios X (EDS), é possível realizar microanálise química qualitativa pontual ou na forma de mapas(3).

Fig.2 - Túbulos dentinários.
Fonte: Site "LabCEMM"(2)

3. MET - Microscópio Eletrônico de Transmissão

Consite em um feixe de elétrons atravessa a amostra sofrendo diversos tipos de espalhamento que dependem das características do material. Imagens de campo claro são formadas por elétrons que sofrem pouco desvio, enquanto as de campo escuro são formadas por elétrons difratados pelos planos cristalinos do material. Interações do feixe com o material geram raios-X característicos que fornecem informações sobre os elementos químicos presentes na amostra.

A técnica possibilita a aquisição de imagens com resolução muito superior às obtidas com microscópios ópticos comuns, em consequência da utilização de elétrons para a formação das imagens(4).

Fig.3 - Célula tronco mesenquimal humana para pré-adipócito.
Fonte: Site "LabCEMM"(2).

Referências:

1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA: Aplicações e Preparações de amostras. Porto Alegre: Edipucrs, 2007. Disponível em: http://www.pucrs.br/edipucrs/online/microscopia.pdf 

2. Site LabCEMM. Disponível em: http://www.pucrs.br/ideia/labcemm/
3. MEV-FEG - Microscopia Eletrônica de Alta Resolução. Araraquara: UNESP, 2018. Disponível em: https://www.iq.unesp.br/#!/laboratorios-multiusuarios/feg-mev3371/apresentacao/

4. MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão. Recife: CETENE, 2018. Disponível em: https://www.cetene.gov.br/pdf/met.pdf

Técnicas e Práticas - Coloração de lâminas permanentes

As secções feitas à mão livre ou em micrótomo podem ser coradas em apenas um corante, em dois (dupla coloração) ou em três (tripla coloração). 

Na aula prática de histologia vegetal fizemos duas colorações(1): 

1ª Coloração: Dupla coloração, onde imergimos as lâminas no azul de toluidina por 3 minutos. As lâminas foram lavadas, para retirar todo o excesso da toluidina e em seguida foram imersas novamente no azul de toluidina por 5 minutos, lavadas e então para finalizar foram imersas na fucsina báscia por 20 segundos. As lâminas foram lavadas e sobrepostas na placa de aquecimento para secagem.

Fig.1 - À esquerda, azul de toluidina, e à direita a fucsina básica.
Fonte: Arquivo pessoal.

                     

Fig. 2 - Lâminas coradas e sobrepostas na placa de aquecimento para secagem.

Fonte: Arquivo pessoal.

2ª Coloração: Após todo o procedimento da microtomia em um bloquinho de gramínea, fizemos a coloração dos cortes com azul de toluidina 0,05%, onde as lâminas foram imersas por 2 minutos. Seguiu-se o mesmo procedimento de lavagem e secagem da 1ª coloração.

Fig.4 - Processo de secagem.
Fonte: ARquivo pessoal.

Fig.3 - Lâminas imersas no azul de toluidina
Fonte: Arquivo pessoal.

Fig.5 - Lâminas completamente secas e devidamente coradas.
Fonte: Arquivo pessoal.

Após finalizado o processo de secagem as lâminas estão prontas para serem montadas com "Entellan". É colocado apenas uma gota de entellan sobre o corte e, com cuidado para não formar bolhas, coloca-se a lamínula por cima e deixa-se secar.

Fig.6 - Lâminas secando após finalizar o processo de montagem com entellan.
Fonte: Arquivo pessoal.

No final deste processo é possível visualizar a amostra no microscópio óptico, onde podemos observar a epiderme adaxial/abaxial, parênquimas, estômatos, tricoma, xilema e floema, conforme as imagens abaixo.

Fig.8 - Lâmina de gramínea, onde está visível o tricoma, na 
ponta do risco rosa.
Fonte: Arquivo pessoal.

Fig.7 - Lâmina de gramínea, onde estão visíveis

a epiderme adaxial/abaxial, parênquima, estômatos,

xilema e floema.

Fonte: Arquivo pessoal.

Referências:

1. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 28; 2005.

Técnicas e Práticas - Microtomia

O micrótomo é um aparelho destinado à seccionar os blocos de parafina ou historesina em fatias extremamente delgadas, variando, normalmente, de 1 a 10 um.

Independente do modelo, os micrótomos possuem duas partes principais: um porta-objeto, que suporta o bloco de historesina durante o processo, e um porta-navalha, que prende a navalha utilizada para efetuar as secções. Os cortes ocorrem com o deslocamento sucessivo do bloco de historesina de cima pra baixo, manipulando o disco num movimento rotacional sempre contra a navalha(1).

Fig.1 - Representação esquemática do micrótomo.
Fonte: Site "Vidraria de Laboratório"(2)

Fig.2 - Micrótomo disponível no laboratório de histologia do IFRS - Campus PoA
Fonte: Arquivo pessoal.

As secções obtidas no micrótomo são distendidas num recipiente com água morna a quente, ou banho histológico, e com o auxílio de um pincel são colocados sobre uma lâmina histológica limpa previamente albuminizada(1).

Fig.3 - Procedimento para realização da microtomia. Ao lado esquerdo o recipiente para o banho histológico.
Fonte: Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal" - Nanda Couto(3).

Após os cortes estarem devidamente dispostos sobre as lâminas, as mesmas são levadas para uma placa de aquecimento, onde vai acelerar o processo de secagem das lâminas, estando prontas para a coloração.

Fig.4 - Lâminas prontas sobre a placa de aquecimento.
Fonte: Arquivo pessoal.

Referências:

1. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Morfologia Animal: aspectos teóricos e práticos - cáp. 7, pág 177 - 178; 2014.

2. Site "Vidraria de Laboratório". Disponível em: http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/microtomo/microtomo-manual-rotativo-01/

3. Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal", por Nanda Couto. Disponível em: https://histotecnica-vegetal.webnode.com/

Técnicas e Práticas - Emblocamento em Historresina

A obtenção de lâminas permanentes em relação às temporárias e semi-permanentes, demanda maior  investimento de tempo, de materiais e equipamentos específicos. Porém quando bem conservadas em laminários podem durar muitos anos. Há diversas técnicas que podem ser utilizadas para a confecção de lâminas permanentes e estas diferem principalmente na escolha da substância utilizada na infiltração e suas particularidades. Na histotécnica animal se utiliza a parafina para emblocamento, enquanto na histotécnica vegetal é mais comum a utilização da historesina.

O passo à passo para a preparação de lâminas permanentes a partir de material fixado (FAA70, Karnowski, etc) e armazenado em álcool 70% são os seguintes(1):

1. Desidratação:

Para a desidratação a amostra deverá seguir em uma sequência crescente de álcool etílico (PA) 70%, 80%, 90% e 95%(2), permanecendo 30 minutos em cada etapa. Nesta desidratação a água presente no material é retirada, o que garantirá uma boa infiltração posterior(1). As amostras utilizadas foram de chuchu e folha de Brinco de Princesa.

  

2. Pré-Infiltração:

Para a pré-infiltração foram utilizados 0,2 mL da solução de pré-infiltração e 0,5 mL da solução de infiltração no eppendorf. Para o meio de emblocamento foram utilizados 0,4 mL em cada forminha, num total de 1,1 mL de resina líquida por amostra(2). 

2.1. Infiltração:  

Para a infiltração são necessários 10mL de resina líquida + 0,1g do pó ativador, chamada de MEIO A. Colocar no agitador magnético até a completa dissolução. Esta solução pode ser armazenada por diversas semanas a 4oC, em um frasco vedado e protegido da luz. Para fazer a solução de pré-infiltração misturar com álcool 95% 1:1. Deve-se utilizar também uma bomba a vácuo(3).

Existem diversos meios para infiltração e inclusão de material vegetal: parafina, “paraplast”, polietilenoglicol e resinas sintéticas (Kraus & Arduin 1997). Estes meios tornam a amostra resistente para suportar os impactos provenientes do processo de seccionamento. Nesta aula prática foi utilizado historesina(1).

3. Historesina:

A historesina se encontra a venda no mercado em kits de hidroxietilmetacrilato (historresina) com as substâncias e instruções de procedimento de uso. Basicamente, após a retirado do álcool 100% do material será necessário deixá-lo em uma solução de infiltração de historresina com álcool etílico 96% durante toda a noite. Após, a amostra segue para 4h em solução pura de hidroxietilmetacrilato. Existem placas de plásticos específicas com poços para colocar o material a ser seccionado e a historresina pura com solução endurecedora após ativação da reação de polimerização(1).

Fig.1 - Forminha com as amostras, armazenada na bomba a vácuo.
Fonte: Arquivo pessoal.

4. Polimerização:

Técnica realizada em capela. A solução de polimerização é chamada de MEIO B, que consite na mistura do MEIO A + Hardner (endurecedor), preparada em recipiente de vidro(3). 

Foram utilizados 15mL de solução de infiltração + 1 mL de hardener. Mistura-se bem, de preferência com agitador magnético) e deve ser utilizada imediatamente. 

OBS.: a polimerização ocorre mais rapidamente em grandes quantidades e no calor(2).

5. Emblocamento: 

Preparar o meio de emblocamento e imediatamente colocá-lo nas forminhas. Dispor as amostras dentro das forminhas e orientá-las cuidadosamente. Manter a forma parada, sobre uma placa aquecida até o início da polimerização. Depois, transferir para estufa 40-50 oC até o endurecimento completo. OBS.: este processo deve ser realizado com rapidez. Após o endurecimento as amostras são desenformadas e os blocos colados com “super-bonder” em um suporte de madeira. A partir deste material são feitos os cortes em micrótomo, dispostos em lâmina e posteriormente corados. A montagem das lâminas é feita com resina sintética (tipo “entellan”) coberta com lamínula(2).

Fig.2 - Forminha já disposta na estufa para acelerar seu processo de endurecimento.
Fonte: Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal" - Nanda Couto(4)

O resultado que se obtém na finalização do processo de emblocamento está representado na imagem abaixo:

Fig.3 - Bloco de historesina finalizado.

Fonte: Arquivo pessoal.

Referências:

1. LAVEG - Laboratório de Anatomia Vegetal. UFSC. Disponível em: https://laveg.paginas.ufsc.br/roteiro-ilustrado/material-e-metodos/

2. Roteiro de aula prática elaborado pela professora Márcia Bündchen.

3. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 24 a 26; 2005.

4. Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal", por Nanda Couto. Disponível em: https://histotecnica-vegetal.webnode.com/