Técnicas e Práticas - Emblocamento em Historresina

A obtenção de lâminas permanentes em relação às temporárias e semi-permanentes, demanda maior  investimento de tempo, de materiais e equipamentos específicos. Porém quando bem conservadas em laminários podem durar muitos anos. Há diversas técnicas que podem ser utilizadas para a confecção de lâminas permanentes e estas diferem principalmente na escolha da substância utilizada na infiltração e suas particularidades. Na histotécnica animal se utiliza a parafina para emblocamento, enquanto na histotécnica vegetal é mais comum a utilização da historesina.

O passo à passo para a preparação de lâminas permanentes a partir de material fixado (FAA70, Karnowski, etc) e armazenado em álcool 70% são os seguintes(1):

1. Desidratação:

Para a desidratação a amostra deverá seguir em uma sequência crescente de álcool etílico (PA) 70%, 80%, 90% e 95%(2), permanecendo 30 minutos em cada etapa. Nesta desidratação a água presente no material é retirada, o que garantirá uma boa infiltração posterior(1). As amostras utilizadas foram de chuchu e folha de Brinco de Princesa.

  

2. Pré-Infiltração:

Para a pré-infiltração foram utilizados 0,2 mL da solução de pré-infiltração e 0,5 mL da solução de infiltração no eppendorf. Para o meio de emblocamento foram utilizados 0,4 mL em cada forminha, num total de 1,1 mL de resina líquida por amostra(2). 

2.1. Infiltração:  

Para a infiltração são necessários 10mL de resina líquida + 0,1g do pó ativador, chamada de MEIO A. Colocar no agitador magnético até a completa dissolução. Esta solução pode ser armazenada por diversas semanas a 4oC, em um frasco vedado e protegido da luz. Para fazer a solução de pré-infiltração misturar com álcool 95% 1:1. Deve-se utilizar também uma bomba a vácuo(3).

Existem diversos meios para infiltração e inclusão de material vegetal: parafina, “paraplast”, polietilenoglicol e resinas sintéticas (Kraus & Arduin 1997). Estes meios tornam a amostra resistente para suportar os impactos provenientes do processo de seccionamento. Nesta aula prática foi utilizado historesina(1).

3. Historesina:

A historesina se encontra a venda no mercado em kits de hidroxietilmetacrilato (historresina) com as substâncias e instruções de procedimento de uso. Basicamente, após a retirado do álcool 100% do material será necessário deixá-lo em uma solução de infiltração de historresina com álcool etílico 96% durante toda a noite. Após, a amostra segue para 4h em solução pura de hidroxietilmetacrilato. Existem placas de plásticos específicas com poços para colocar o material a ser seccionado e a historresina pura com solução endurecedora após ativação da reação de polimerização(1).

Fig.1 - Forminha com as amostras, armazenada na bomba a vácuo.
Fonte: Arquivo pessoal.

4. Polimerização:

Técnica realizada em capela. A solução de polimerização é chamada de MEIO B, que consite na mistura do MEIO A + Hardner (endurecedor), preparada em recipiente de vidro(3). 

Foram utilizados 15mL de solução de infiltração + 1 mL de hardener. Mistura-se bem, de preferência com agitador magnético) e deve ser utilizada imediatamente. 

OBS.: a polimerização ocorre mais rapidamente em grandes quantidades e no calor(2).

5. Emblocamento: 

Preparar o meio de emblocamento e imediatamente colocá-lo nas forminhas. Dispor as amostras dentro das forminhas e orientá-las cuidadosamente. Manter a forma parada, sobre uma placa aquecida até o início da polimerização. Depois, transferir para estufa 40-50 oC até o endurecimento completo. OBS.: este processo deve ser realizado com rapidez. Após o endurecimento as amostras são desenformadas e os blocos colados com “super-bonder” em um suporte de madeira. A partir deste material são feitos os cortes em micrótomo, dispostos em lâmina e posteriormente corados. A montagem das lâminas é feita com resina sintética (tipo “entellan”) coberta com lamínula(2).

Fig.2 - Forminha já disposta na estufa para acelerar seu processo de endurecimento.
Fonte: Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal" - Nanda Couto(4)

O resultado que se obtém na finalização do processo de emblocamento está representado na imagem abaixo:

Fig.3 - Bloco de historesina finalizado.

Fonte: Arquivo pessoal.

Referências:

1. LAVEG - Laboratório de Anatomia Vegetal. UFSC. Disponível em: https://laveg.paginas.ufsc.br/roteiro-ilustrado/material-e-metodos/

2. Roteiro de aula prática elaborado pela professora Márcia Bündchen.

3. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 24 a 26; 2005.

4. Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal", por Nanda Couto. Disponível em: https://histotecnica-vegetal.webnode.com/