Técnicas e Práticas - Fixação

Para que se possa ver ao microscópio óptico as células vegetais, antes de tudo é preciso preparar as lâminas. Há várias técnicas de fixação, corte e coloração do material.

1. Fixação

Os fixadores são soluções usadas para a preservação de células, tecidos e órgãos do material coletado. Os processos vitais das células e tecidos devem ser paralisados, sendo assim necessário que o fixador penetre o mais profundo possível no material(1). O fixador deve paralisar o metabolismo, preservando o formato e os componentes celulares(2).

Para que se tenha uma boa fixação do material é preciso seguir os seguintes passos:

• retirar o ar do material, imerso em água destilada, por meio de uma bomba de vácuo;
• substituir a água destilada pelo fixador adequado;
• seccionar (cortar) o material em peças menores, antes da fixação, para facilitar a penetração do fixador em todos os tecidos e células(1).

Deve-se ter cuidado com alguns fatores que afetam regurlamente a fixação, tais como a temperatura, o pH, taxa de alteração física e química, taxa de penetração e o tempo de fixação, que podem variar de acordo com o tecido.

Podem ocorrer também artefatos de técnica, que são provocados pela alteração ou degradação da forma dos componentes da célula ou pela deposição de materiais estranhos durante a penetração(1).

1.1 Tipos de Fixadores:

• FPA (formaldeído, ácido propiônico e ácido acético)(3): 

Pode ser utilizado para caules lenhosos, caules herbáceos resistentes e raízes velhas(1);

Composição:

formaldeído 37% .................. 50 mL

ácido propiônico ................... 50 mL

etanol 70%............................. 900 mL

• CRAF I (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................20 mL

ácido acético glacial ..............8 mL

formaldeído 37%................... 50 mL 

água destilada ........................922 mL

• CRAF/Nawaschin (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................ 5 mL

ácido acético glacial ..............50 mL

formaldeído 37%................... 200 mL 

água destilada ........................675 mL

• BOUIN (ácido acético glacial, formaldeído, ácido pícrico em solução saturada(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido acético glacial ................................50 mL

formaldeído 37%......................................250 mL 

ácido pícrico, solução saturada ................750 mL

• FAA (formaldeído, ácido acético, álcool)(4):

Este fixador é o mais utilizado na histologia vegetal. O material preservado em FAA pode ser armazenado no próprio fixador ou, após o período de fixação, transferido para uma solução de álcool etílico 70%, pois os vapores de formol e ácido acético são tóxicos, corrosivos e irritantes.

O FAA pode ser produzido com álcool etílico 70%, para tecidos e órgãos mais rígidos, ou 50% para amostras mais delicadas. O tempo de permanência do material no fixador varia de acordo com o tipo e a espessura da amostra, geralmente é indicado a duração de pelo menos 48 horas(2).

A composição de FAA70 abaixo é referente ao produzido em aula, no laboratório de histologia do IFRS - Campus Porto Alegre, ministrado pela professora Márcia.

Composição do FAA70 para 100 mL:

formaldeído 37% ...................................5 mL

ácido acético glacial ..............................5 mL

álcool etílico 70%...................................90 mL

Referências:

1. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 17 a 19; 2005.

2. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 206; 2014.

3.BERLYN, G. P.; MIKSCHE, J. P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames (Iowa): The Iowa State University, 1976.

4. JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. New York: McGraw- Hill. 1940.

Histologia Vegetal

Histologia Vegetal é o estudo de tecidos vegetais. Estes estudos são possíveis a partir do conhecimento prévio sobre as características e funções das células vegetais os diferentes tecidos que as formam (1).

A célula vegetal, diferente da célula animal, apresenta em sua formação parede celular celulósica, vacúolo e os plastídeos.

1.  Parede Celulósica

A parede celular celulósica é a característica principal de uma célula vegetal, que consiste em 3 tipos:

• Parede Celular Primária: primeira a ser formada, acompanha o crescimento da célula, se organiza a partir de uma rede de microfibrilas de celulose, além de hemiceluloses e pectina. Ela é delgada, exceto na colênquima, onde apresenta diferentes padrões de espessamento.
• Parede Celular Secundária: é formada após cessar o crescimento da célula, é impregnada de lignina, uma substância que lhe dá rigidez. A deposição da parede secundária se dá internamente à primária, o que provoca a redução do lúmen celular. As células com parede secundária em geral são mortas na maturidade (1).

Há dois tipos de comunicações intercelulares: os plasmodesmos na parede primária e as pontoações na parede secundária.

Fig.1 Célula da cebola (Allium cepa) vista de um microscópio óptico, estando vísíveis a parede celular, núcleo e nucleolos.
Fonte: Arquivo pessoal

2.  Vacúolo

Ocupando grande parte do volume celular, é revestido por uma membrana chamada tonoplasto. É formado principalmente por água, se solubilizando e formando diferentes substâncias. Suas principais funções consistem na manutenção do turgor celular, regulação do pH e armazenamento de substâncias incluindo pigmentos solúveis em água e cristais de oxalato de cálcio.

Turgor Celular: quando uma célula vegetal encontra-se em meio hipotônico, onde sua concentração de solutos é menor do que a do citoplasma/vacúolo. à medida que a água entra, ocorre uma pressão interna contra a parede celular, chamada de pressão de turgor. A célula é chamada de túrgida.

O oposto dessa situação ocorre quando uma célula vegetal encontra-se em um meio hipertônico, onde sua concentração de solutos é menor do que a do citoplasma/vacúolo. À medida que a água sai, a membrana plasmática se contrai, descolando da parede celular em um processo chamado plasmólise. A célula é chamada de plasmolisada (1).

Fig.2 Célula da planta aquática Elodea sp. vista de um microscópio óptico, numa lâmina onde foi feita a substituição da água por uma solução de sacarose para se observar os cloroplastos que se movimentaram para a parede celular, onde há menos luz.
Fonte: Arquivo pessoal

3. Plastídeos

São organelas revestidas por dupla membrana que têm características muito peculiares, podendo se converter de um tipo ao outro, resultado do estímulo recebido. Os plastídeos podem ser de 3 tipos:

•  Cloroplasto: possui uma organização interna cpmplexa e pigmentos fotossintetizantes, como clorofilas e carotenoides, inseridos em suas membranas. Têm a função de realizar a fotossíntese e são encontrados principalmente nas folhas e em outras partes verdes das plantas.
•  Cromoplasto: possui organização interna menos diferenciada que a do cloroplasto e armazena outros pigmentos, com exceção da clorofila, que dão cor às flores e frutos. Estão relacionados à atração de polinizadores e dispersores de sementes.
•  Leucoplasto: plastídeo desprovido de pigmentos, possuindo a função de armazenamento de substâncias. Os leucoplastos mais comuns são os amiloplastos, que fazem armazenamento de amido em sementes, caules e raízes armazenadores(1).

  

  Fig.3 Célula da planta aquática Elodea sp. vista de um microscópio óptico, estando visíveis a parede celular e os cloroplastos.
  Fonte: Arquivo pessoal

Referência:

1.BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 185 a 188; 2014.

Apresentação do Portfólio

Olá,
Me chamo Gabriele e sou estudante do segundo semestre do curso Técnico em Biotecnologia no IFRS - Campus Porto Alegre.
Este blog faz parte da cadeira de Histotécnica Vegetal, ministrada pela professora Márcia Bündchen, visando a apresentação da cadeira, introduzindo do que consiste uma célula vegetal, quais as técnicas e práticas de fixação, como é uma célula vegetal vista de um microscópio óptico e também será abordado a microscopia eletrônica.