Técnicas e Práticas - Fixação

Para que se possa ver ao microscópio óptico as células vegetais, antes de tudo é preciso preparar as lâminas. Há várias técnicas de fixação, corte e coloração do material.

1. Fixação

Os fixadores são soluções usadas para a preservação de células, tecidos e órgãos do material coletado. Os processos vitais das células e tecidos devem ser paralisados, sendo assim necessário que o fixador penetre o mais profundo possível no material(1). O fixador deve paralisar o metabolismo, preservando o formato e os componentes celulares(2).

Para que se tenha uma boa fixação do material é preciso seguir os seguintes passos:

• retirar o ar do material, imerso em água destilada, por meio de uma bomba de vácuo;
• substituir a água destilada pelo fixador adequado;
• seccionar (cortar) o material em peças menores, antes da fixação, para facilitar a penetração do fixador em todos os tecidos e células(1).

Deve-se ter cuidado com alguns fatores que afetam regurlamente a fixação, tais como a temperatura, o pH, taxa de alteração física e química, taxa de penetração e o tempo de fixação, que podem variar de acordo com o tecido.

Podem ocorrer também artefatos de técnica, que são provocados pela alteração ou degradação da forma dos componentes da célula ou pela deposição de materiais estranhos durante a penetração(1).

1.1 Tipos de Fixadores:

• FPA (formaldeído, ácido propiônico e ácido acético)(3): 

Pode ser utilizado para caules lenhosos, caules herbáceos resistentes e raízes velhas(1);

Composição:

formaldeído 37% .................. 50 mL

ácido propiônico ................... 50 mL

etanol 70%............................. 900 mL

• CRAF I (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................20 mL

ácido acético glacial ..............8 mL

formaldeído 37%................... 50 mL 

água destilada ........................922 mL

• CRAF/Nawaschin (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................ 5 mL

ácido acético glacial ..............50 mL

formaldeído 37%................... 200 mL 

água destilada ........................675 mL

• BOUIN (ácido acético glacial, formaldeído, ácido pícrico em solução saturada(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido acético glacial ................................50 mL

formaldeído 37%......................................250 mL 

ácido pícrico, solução saturada ................750 mL

• FAA (formaldeído, ácido acético, álcool)(4):

Este fixador é o mais utilizado na histologia vegetal. O material preservado em FAA pode ser armazenado no próprio fixador ou, após o período de fixação, transferido para uma solução de álcool etílico 70%, pois os vapores de formol e ácido acético são tóxicos, corrosivos e irritantes.

O FAA pode ser produzido com álcool etílico 70%, para tecidos e órgãos mais rígidos, ou 50% para amostras mais delicadas. O tempo de permanência do material no fixador varia de acordo com o tipo e a espessura da amostra, geralmente é indicado a duração de pelo menos 48 horas(2).

A composição de FAA70 abaixo é referente ao produzido em aula, no laboratório de histologia do IFRS - Campus Porto Alegre, ministrado pela professora Márcia.

Composição do FAA70 para 100 mL:

formaldeído 37% ...................................5 mL

ácido acético glacial ..............................5 mL

álcool etílico 70%...................................90 mL

Referências:

1. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 17 a 19; 2005.

2. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 206; 2014.

3.BERLYN, G. P.; MIKSCHE, J. P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames (Iowa): The Iowa State University, 1976.

4. JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. New York: McGraw- Hill. 1940.