Técnicas e Práticas - Coloração

Antes de se fazer a coloração do corte, a etapa de clarificação é muito importante para que se obtenha um material preferencialmente transparente, e então na etapa de coloração o corante penetre facilmente na amostra.

A clarificação pode ser realizada com o hipoclorito de sódio, popularmente conhecido como água sanitária.

A partir desta solução, cuja concentração de cloro é cerca de 2%, é feita a diluição nas seguintes proporções(1):

60 mL de água destilada + 40 mL de água sanitária = 100 mL de solução clarificadora.

Procedimento:

• Deve-se manter os cortes nessa solução até que se tornem quase transparentes;
• Após a clarificação, fazer a lavagem do material, transferindo-o  pelo menos três vezes para placas de Petri com água destilada.
• Após a lavagem, passar os cortes por água acidificada (água destilada com algumas gotas de ácido), para neutralizar, por mais ou menos 3 minutos, e transfira-os novamente para água destilada(1).

Fig.1 - Etapa de clarificação das amostras
Fonte: Arquivo pessoal

Essas duas últimas etapas são fundamentais, para que se neutralize a amostra, pois os corantes reagem conforme a composição química da amostra, dando colorações diferenciadas em meio ácido e em meio básico.

Com a finalização da clarificação, pode-se fazer a coloração da amostra.

3. Coloração

A coloração é a etapa fundamental do preparo do material para a microscopia, pois com a utilização dos corantes adequados as estruturas celulares ficam evidentes(1).

Há diversos tipos de corantes disponíveis. Alguns corantes são metacromáticos, que coram determinados componentes e estruturas celulares com uma cor diferente do próprio corante(1).

3.1. Tipos de Corantes: os corantes abaixo foram preparados em aula, no laboratório de histologia do IFRS - Campus Porto Alegre, ministrado pela professora Márcia.

• Azul de anilina 0,5% em etanol 50%

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 2,5 g de azul de anilina. Em um becker com 500 mL de etanol 50%, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

• Safranina 1% em solução aquosa

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 1,0 g de safranina. Em um becker com 500 mL de água destilada, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

• Azul de toluidina 0,05% em solução aquosa

Este corante promove a coloração de qualidade superior em tecidos vegetais. Na concentração 0,05% a parede celular secundária lignificada cora-se em azul brilhante, enquanto a parede celualr primária varia de azul até lilás. 

A histoquímica é o uso de corantes específicos que reagem com a amostra e identificam sua natureza química(1).

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 0,025 g de azul de toluidina. Em um becker com 500 mL de água destilada, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

Fig.2 - Finalização da coloração das amostras
Fonte: Arquivo pessoal

Referências:

1. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 208 - 209; 2014.