Técnicas e Práticas - Preparo e Montagem de Lâminas

4. Preparação de Lâminas

A preparação de lâminas histológicas é uma etapa importante para que se tenha um resultado final  de fácil observação ao microscópio óptico.

As lâminas de células, tecidos ou órgãos para estudo ao microscópio óptico podem ser de três tipos(1):

•  Lâmina Temporária

Serve para observações rápidas e para testes histoquímicos. Para a preparação:

> uma lâmina limpa;

> colocar sobre ela uma gota de água ou glicerina 33%;

> obter o corte do material;

> fazer a clarificação do corte em hipoclorito de sódio;

> corar a secção com o corante adequado;

> depositar o corte cuidadosamente em água ou glicerina;

> cobrir cuidadosamente a preparação com uma lamínula

• Lâmina Semipermante

É mais duradoura que a temporária, durando em média 6 meses. Para a preparação:

> fazer o corte à mão livre ou em micrótomo, fazer a clarificação em hipoclorito de sódio 33%, lavá-la em água destilada e corá-la com o corante adequado;

> montar o corte com uma gota de glicerina 33% entre lâmina e lamínula;

>após a montagem, vedar a lâmina com esmalte incolor;

>etiquetar a lâmina com informações como: nome da espécie, órgão ou a estrutura; tipo de corte; corante usado; fixador e data(1).

Fig. 1 - Lâmina finalizada
Fonte: Arquivo pessoal

• Lâmina Permanente

As lâminas permanentes podem ser emblocadas em parafina(2), polietilenoglicol(3), goma glicerinada(4) ou historresina. Na historresina envolve as etapas de fixação, desidratação, parainfiltração, inflitração, polimerização, retirada dos blocos do moldes, montagem dos blocos e corte do material em micrótomo de rotação(1).

Fig.3 - Bloco de historresina
Fonte: Arquivo pessoal

Fig.2 - Bloco de historresina
Fonte: Arquivo pessoal

Finalizando o processo de preparo e montagem das lâminas, com o resultado final será possível a visualização da amostra ao microscópio óptico, como nas figuras abaixo:

Fig. 5 - Amostra finalizada
Fonte: Arquivo pessoal

Fig. 4 - Amostra finalizada
Fonte: Arquivo pessoal

Referências:

1. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 21 a 27; 2005.

2. JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. New York: McGraw- Hill. 1940.

3.KRAUS & ARDUIN, 1997

4. COE & MARTIN, 1920

5. CARMELLO-GUERREIRO, S. M. Técnica de inclusão de material vegetal em historresina. Botucatu: Departamento de Botânica da UNESP, 1995.

Técnicas e Práticas - Coloração

Antes de se fazer a coloração do corte, a etapa de clarificação é muito importante para que se obtenha um material preferencialmente transparente, e então na etapa de coloração o corante penetre facilmente na amostra.

A clarificação pode ser realizada com o hipoclorito de sódio, popularmente conhecido como água sanitária.

A partir desta solução, cuja concentração de cloro é cerca de 2%, é feita a diluição nas seguintes proporções(1):

60 mL de água destilada + 40 mL de água sanitária = 100 mL de solução clarificadora.

Procedimento:

• Deve-se manter os cortes nessa solução até que se tornem quase transparentes;
• Após a clarificação, fazer a lavagem do material, transferindo-o  pelo menos três vezes para placas de Petri com água destilada.
• Após a lavagem, passar os cortes por água acidificada (água destilada com algumas gotas de ácido), para neutralizar, por mais ou menos 3 minutos, e transfira-os novamente para água destilada(1).

Fig.1 - Etapa de clarificação das amostras
Fonte: Arquivo pessoal

Essas duas últimas etapas são fundamentais, para que se neutralize a amostra, pois os corantes reagem conforme a composição química da amostra, dando colorações diferenciadas em meio ácido e em meio básico.

Com a finalização da clarificação, pode-se fazer a coloração da amostra.

3. Coloração

A coloração é a etapa fundamental do preparo do material para a microscopia, pois com a utilização dos corantes adequados as estruturas celulares ficam evidentes(1).

Há diversos tipos de corantes disponíveis. Alguns corantes são metacromáticos, que coram determinados componentes e estruturas celulares com uma cor diferente do próprio corante(1).

3.1. Tipos de Corantes: os corantes abaixo foram preparados em aula, no laboratório de histologia do IFRS - Campus Porto Alegre, ministrado pela professora Márcia.

• Azul de anilina 0,5% em etanol 50%

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 2,5 g de azul de anilina. Em um becker com 500 mL de etanol 50%, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

• Safranina 1% em solução aquosa

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 1,0 g de safranina. Em um becker com 500 mL de água destilada, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

• Azul de toluidina 0,05% em solução aquosa

Este corante promove a coloração de qualidade superior em tecidos vegetais. Na concentração 0,05% a parede celular secundária lignificada cora-se em azul brilhante, enquanto a parede celualr primária varia de azul até lilás. 

A histoquímica é o uso de corantes específicos que reagem com a amostra e identificam sua natureza química(1).

Materiais: becker, espátula, agitador magnético, vidro de relógio, bastão de vidro, papel alumínio, balança analítica.

Método: com o auxílio de papel alumínio e espátula, foram pesados na balança analítica 0,025 g de azul de toluidina. Em um becker com 500 mL de água destilada, foi adicionado o corante e agitou-se com o auxílio do agitador magnético por uns 10 minutos até se obter uma solução homogênea.

Fig.2 - Finalização da coloração das amostras
Fonte: Arquivo pessoal

Referências:

1. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 208 - 209; 2014.

Técnicas e Práticas - Corte

2. Cortes

Os cortes podem ser obtidos à mão livre, com o auxílio de lâmina de barbear, ou com o material incluído em meios sintéticos e seccionado em micrótomo rotativo. O glicolmetacrilato é uma alternativa ao emblocamento em parafina. Seu uso se justifica pela praticidade e rapidez do procedimento, a pequena quantidade de reagentes que consome, baixa toxicidade do produto em comparação com outros e, consequentemente, pela menor exposição de quem o manipula.

O glicolmetacrilato também favorece uma excelente qualidade no resultado final. As lâminas produzidas com amostras incluídas em glicolmetacrilato utilizam meios de montagem sintéticos, como por exemplo Entellan, e são chamadas de lâminas permanentes, pois se preservam indefinidademente(1).

Os cortes histológicos feitos à mão livre são de excelente qualidade para se estudar a epiderme, parênquima, colênquima, esclerênquima, tecidos secretores e meristemas secundários como o câmbio vascular. Para tecidos mais delicados, como meristemas primários, ou muito rígidos como a madeira, necessitam de outras técnicas para a obtenção de cortes histológicos de qualidade.

Estes cortes devem ser delgados o suficiente para que a luz do micoroscópio óptico consiga atravessá-los(1).

Nas folhas em que o formato é plano são utilizados cortes paradérmicos e cortes transversais. Para caules, cujo formato é cilíndrico, são utilizados os planos de corte transversal, longitudinal radial e longitudinal tangencial(1).

Fig.1 Tipos de cortes histológicos: 2 - seção transversal; 3 - seções longitudinal, radial e tangencial; 4 - seções longitudinal, anticlinal e paradérmica ou periclinal
Fonte: Morfologia & Anatomia - Técnicas e Práticas(2)

Cortes à mão livre de órgãos relativamente rígidos, como caules jovens, são realizados segurando a amostra diretamente com a mão, tendo em vista que a amostra não sofrerá deformação com o contato da lâmina de barbear.
Para órgãos mais delgados e tenros, é necessário o uso de suportes feitos com isopor, por exemplo(1).

 2.1. Corte paradérmico adaxial: corte feito na parte lisa, "de cima" da folha.

Fig. 2 - corte adaxial adaxial da folha de Costus spicatus conhecida popularmente como Cana de macaco.
Fonte: Blog "EDP - III", por Jacqueline Manzan(3)

2.2. Corte paradérmico abaxial: corte feito na parte áspera, "de baixo" da folha

Fig. 2 - corte adaxial abaxial da folha de Costus spicatus conhecida popularmente como Cana de macaco.
Fonte: Blog "EDP - III", por Jacqueline Manzan(3)

2.3. Corte transversal com suporte: corte transversal feito com suporte de isopor

Fig. 3 - Corte da folha Brinco de Princesa, feito em aula prática de histotécnica vegetal, demonstrado por minha colega Nanda Couto.

Fonte: Blog "O Fenomenal Mundo Vegetal" - Nanda Couto(4).

Referências:

1. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 206 - 208; 2014.

2. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 19 a 20; 2005.
3. Blog EDP - III, por Jacqueline Manzan. Disponível em https://edptres.blogspot.com/2011/05/os-tipos-de-corte-mao-livre.html

4. Blog O Fenomenal Mundo Vegetal, por Nanda Couto. Disponível em: https://histotecnica-vegetal.webnode.com/

Técnicas e Práticas - Fixação

Para que se possa ver ao microscópio óptico as células vegetais, antes de tudo é preciso preparar as lâminas. Há várias técnicas de fixação, corte e coloração do material.

1. Fixação

Os fixadores são soluções usadas para a preservação de células, tecidos e órgãos do material coletado. Os processos vitais das células e tecidos devem ser paralisados, sendo assim necessário que o fixador penetre o mais profundo possível no material(1). O fixador deve paralisar o metabolismo, preservando o formato e os componentes celulares(2).

Para que se tenha uma boa fixação do material é preciso seguir os seguintes passos:

• retirar o ar do material, imerso em água destilada, por meio de uma bomba de vácuo;
• substituir a água destilada pelo fixador adequado;
• seccionar (cortar) o material em peças menores, antes da fixação, para facilitar a penetração do fixador em todos os tecidos e células(1).

Deve-se ter cuidado com alguns fatores que afetam regurlamente a fixação, tais como a temperatura, o pH, taxa de alteração física e química, taxa de penetração e o tempo de fixação, que podem variar de acordo com o tecido.

Podem ocorrer também artefatos de técnica, que são provocados pela alteração ou degradação da forma dos componentes da célula ou pela deposição de materiais estranhos durante a penetração(1).

1.1 Tipos de Fixadores:

• FPA (formaldeído, ácido propiônico e ácido acético)(3): 

Pode ser utilizado para caules lenhosos, caules herbáceos resistentes e raízes velhas(1);

Composição:

formaldeído 37% .................. 50 mL

ácido propiônico ................... 50 mL

etanol 70%............................. 900 mL

• CRAF I (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................20 mL

ácido acético glacial ..............8 mL

formaldeído 37%................... 50 mL 

água destilada ........................922 mL

• CRAF/Nawaschin (ácido crômico, ácido acético glacial, formaldeído, água destilada)(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido crômico 10%................ 5 mL

ácido acético glacial ..............50 mL

formaldeído 37%................... 200 mL 

água destilada ........................675 mL

• BOUIN (ácido acético glacial, formaldeído, ácido pícrico em solução saturada(3): 

Pode ser utilizado para ápices de raízes  e para estudos de sacos embrionários(1);

Composição:

ácido acético glacial ................................50 mL

formaldeído 37%......................................250 mL 

ácido pícrico, solução saturada ................750 mL

• FAA (formaldeído, ácido acético, álcool)(4):

Este fixador é o mais utilizado na histologia vegetal. O material preservado em FAA pode ser armazenado no próprio fixador ou, após o período de fixação, transferido para uma solução de álcool etílico 70%, pois os vapores de formol e ácido acético são tóxicos, corrosivos e irritantes.

O FAA pode ser produzido com álcool etílico 70%, para tecidos e órgãos mais rígidos, ou 50% para amostras mais delicadas. O tempo de permanência do material no fixador varia de acordo com o tipo e a espessura da amostra, geralmente é indicado a duração de pelo menos 48 horas(2).

A composição de FAA70 abaixo é referente ao produzido em aula, no laboratório de histologia do IFRS - Campus Porto Alegre, ministrado pela professora Márcia.

Composição do FAA70 para 100 mL:

formaldeído 37% ...................................5 mL

ácido acético glacial ..............................5 mL

álcool etílico 70%...................................90 mL

Referências:

1. SOUZA, Luiz Antonio de et al. Morfologia & Anatomia Vegetal - Técnicas e Práticas; Parte I, pág 17 a 19; 2005.

2. BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 206; 2014.

3.BERLYN, G. P.; MIKSCHE, J. P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames (Iowa): The Iowa State University, 1976.

4. JOHANSEN, D. A. Plant Microtechnique. New York: McGraw- Hill. 1940.

Histologia Vegetal

Histologia Vegetal é o estudo de tecidos vegetais. Estes estudos são possíveis a partir do conhecimento prévio sobre as características e funções das células vegetais os diferentes tecidos que as formam (1).

A célula vegetal, diferente da célula animal, apresenta em sua formação parede celular celulósica, vacúolo e os plastídeos.

1.  Parede Celulósica

A parede celular celulósica é a característica principal de uma célula vegetal, que consiste em 3 tipos:

• Parede Celular Primária: primeira a ser formada, acompanha o crescimento da célula, se organiza a partir de uma rede de microfibrilas de celulose, além de hemiceluloses e pectina. Ela é delgada, exceto na colênquima, onde apresenta diferentes padrões de espessamento.
• Parede Celular Secundária: é formada após cessar o crescimento da célula, é impregnada de lignina, uma substância que lhe dá rigidez. A deposição da parede secundária se dá internamente à primária, o que provoca a redução do lúmen celular. As células com parede secundária em geral são mortas na maturidade (1).

Há dois tipos de comunicações intercelulares: os plasmodesmos na parede primária e as pontoações na parede secundária.

Fig.1 Célula da cebola (Allium cepa) vista de um microscópio óptico, estando vísíveis a parede celular, núcleo e nucleolos.
Fonte: Arquivo pessoal

2.  Vacúolo

Ocupando grande parte do volume celular, é revestido por uma membrana chamada tonoplasto. É formado principalmente por água, se solubilizando e formando diferentes substâncias. Suas principais funções consistem na manutenção do turgor celular, regulação do pH e armazenamento de substâncias incluindo pigmentos solúveis em água e cristais de oxalato de cálcio.

Turgor Celular: quando uma célula vegetal encontra-se em meio hipotônico, onde sua concentração de solutos é menor do que a do citoplasma/vacúolo. à medida que a água entra, ocorre uma pressão interna contra a parede celular, chamada de pressão de turgor. A célula é chamada de túrgida.

O oposto dessa situação ocorre quando uma célula vegetal encontra-se em um meio hipertônico, onde sua concentração de solutos é menor do que a do citoplasma/vacúolo. À medida que a água sai, a membrana plasmática se contrai, descolando da parede celular em um processo chamado plasmólise. A célula é chamada de plasmolisada (1).

Fig.2 Célula da planta aquática Elodea sp. vista de um microscópio óptico, numa lâmina onde foi feita a substituição da água por uma solução de sacarose para se observar os cloroplastos que se movimentaram para a parede celular, onde há menos luz.
Fonte: Arquivo pessoal

3. Plastídeos

São organelas revestidas por dupla membrana que têm características muito peculiares, podendo se converter de um tipo ao outro, resultado do estímulo recebido. Os plastídeos podem ser de 3 tipos:

•  Cloroplasto: possui uma organização interna cpmplexa e pigmentos fotossintetizantes, como clorofilas e carotenoides, inseridos em suas membranas. Têm a função de realizar a fotossíntese e são encontrados principalmente nas folhas e em outras partes verdes das plantas.
•  Cromoplasto: possui organização interna menos diferenciada que a do cloroplasto e armazena outros pigmentos, com exceção da clorofila, que dão cor às flores e frutos. Estão relacionados à atração de polinizadores e dispersores de sementes.
•  Leucoplasto: plastídeo desprovido de pigmentos, possuindo a função de armazenamento de substâncias. Os leucoplastos mais comuns são os amiloplastos, que fazem armazenamento de amido em sementes, caules e raízes armazenadores(1).

  

  Fig.3 Célula da planta aquática Elodea sp. vista de um microscópio óptico, estando visíveis a parede celular e os cloroplastos.
  Fonte: Arquivo pessoal

Referência:

1.BRUNO, Alessandra Nejar et al. Biotecnologia I (IFRS) - Princípios e Métodos. Histologia Vegetal - cáp. 8, pág 185 a 188; 2014.

Apresentação do Portfólio

Olá,
Me chamo Gabriele e sou estudante do segundo semestre do curso Técnico em Biotecnologia no IFRS - Campus Porto Alegre.
Este blog faz parte da cadeira de Histotécnica Vegetal, ministrada pela professora Márcia Bündchen, visando a apresentação da cadeira, introduzindo do que consiste uma célula vegetal, quais as técnicas e práticas de fixação, como é uma célula vegetal vista de um microscópio óptico e também será abordado a microscopia eletrônica.